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病毒包裝


干擾慢病毒/過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建

   1.服務(wù)描述

     干擾慢病毒構(gòu)建:一般情況下,RNA干擾實(shí)驗(yàn)是通過(guò)化學(xué)合成小片段siRNA,或者構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)RNA干擾。但是這兩種方式對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如原代細(xì)胞,干細(xì)胞,懸浮細(xì)胞等)往往因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率低而導(dǎo)致RNA干擾實(shí)驗(yàn)失敗。而通過(guò)構(gòu)建慢病毒shRNA干擾質(zhì)粒并包裝病毒,再用病毒侵染靶細(xì)胞能很好的解決這一難題。
     過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建:cDNA過(guò)表達(dá)慢病毒包裝是根據(jù)客戶提供的目的基因信息,將其構(gòu)建至所需的慢病毒過(guò)表達(dá)載體中,與其余的慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞包裝獲得過(guò)表達(dá)目的基因的慢病毒顆粒。

 

  2.服務(wù)內(nèi)容(干擾/過(guò)表達(dá))

  1:shRNA干擾靶點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)/目的基因調(diào)??;

  2:shRNA 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建/過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建;

  3:shRNA慢病毒包裝與病毒滴度測(cè)定/過(guò)表達(dá)慢病毒包裝與病毒滴度測(cè)定;

 

  3.服務(wù)說(shuō)明

   1:我們的RNA干擾及過(guò)表達(dá)服務(wù)針對(duì)所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,暫不提供植物和原核生物的RNA干擾服務(wù);

   2:對(duì)象可以是編碼蛋白的mRNA序列,也可以是長(zhǎng)的非編碼RNA(lncRNA)序列;

   3:針對(duì)不同的靶基因,我們一般設(shè)計(jì)3-4條干擾序列,保證至少有一條序列干擾效果大于70%(RNA水平)。也可由客戶提供干擾靶點(diǎn),但我們不保證干擾效果;

   4:我們提供多個(gè)慢病毒載體供客戶選擇(見(jiàn)下方載體信息);

   5:我公司包裝的shRNA干擾慢病毒顆粒滴度可以達(dá)到1×109TU/ml,完全能夠滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn);


  4.客戶所得

    1:構(gòu)建好的shRNA/過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒;

   2:合同規(guī)定量的慢病毒顆粒及對(duì)照病毒顆粒;

   3:完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告(包括實(shí)驗(yàn)材料,實(shí)驗(yàn)步驟,實(shí)驗(yàn)結(jié)果等);


5.載體信息

   干擾慢病毒構(gòu)建從靶點(diǎn)設(shè)計(jì)到慢病毒滴度測(cè)定完成需21個(gè)工作日;

    過(guò)表達(dá)慢病毒構(gòu)建從基因調(diào)取到慢病毒滴度測(cè)定完成需27個(gè)工作日;

 

 

miRNA 的過(guò)表達(dá)慢病毒包裝

1.服務(wù)描述

  microRNA(miRNA)是一類小片段單鏈RNA , 最初是在核內(nèi)由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄形成具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAA)的pri-miRNA,pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha的作用下被處理成約70個(gè)核苷的pre-miRNA。pre-miRNA被運(yùn)輸出核后再由另外一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切形成約22個(gè)核苷酸的成熟miRNA。成熟的miRNA 與RISC組裝成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA,并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。

  

 

圖示:miRNA的成熟過(guò)程

 

  2.服務(wù)內(nèi)容

  1:miRNA 的過(guò)表達(dá)慢病毒包裝

  我公司采用擴(kuò)增pri-miRNA及其兩端的天然側(cè)翼序列來(lái)構(gòu)建miRNA的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,并包裝慢病毒。以實(shí)現(xiàn)miRNA在體外(內(nèi))的高表達(dá)。該方法相比化學(xué)合成的miRNA,具有可持續(xù)性表達(dá),并且能用于難轉(zhuǎn)染(例如干細(xì)胞,懸浮細(xì)胞等)細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)。比pre-miRNA和mature miRNA 形式的過(guò)表達(dá),具有表達(dá)效果更好,更能模擬體內(nèi)天然的成熟過(guò)程。

  2:miRNA的抑制

  我公司采用TuD RNA(Tough Decoy RNA)的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建miRNA的抑制慢病毒載體。TuD RNA不同于以往的單鏈RNA,它是含有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA , 能夠抵抗胞內(nèi)核酸酶的降解,讓miRNA抑制可持續(xù)一個(gè)月以上。并且,TuD RNA的兩條鏈都包含一個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),能夠更高效地隔離濃度較低的目標(biāo)miRNA。因此,相比其它方法,TuD RNA能夠更長(zhǎng)效的抑制miRNA。

  

 

圖示:TuD RNA的工作原理

 

  3:miRNA的靶基因驗(yàn)證

  由于miRNA是通過(guò)其seed sequence(5’端2-8位核苷酸)與靶基因的3’UTR結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)。因此,我們將待定目的基因的3’UTR區(qū)域構(gòu)建至報(bào)告基因luciferase的后面,通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組報(bào)告基因表達(dá)的改變(監(jiān)測(cè)熒光素酶的活性變化)來(lái)間接反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用。同時(shí)結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確認(rèn)miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

 

  3.服務(wù)說(shuō)明

  1:客戶只需提供miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的miRNA編號(hào),我們就可以按照您的要求完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

  2:miRNA的過(guò)表達(dá)效果受諸多因素影響,與對(duì)照組相比,可以提高2—1000倍(如果本底表達(dá)水平較低,可以達(dá)到較好的過(guò)表達(dá)效果,如果本底表達(dá)水平較高,過(guò)表達(dá)效果會(huì)相對(duì)較低)。

  3:我們提供多個(gè)microRNA慢病毒載體供客戶選擇(見(jiàn)下方載體信息);

 

  4.客戶所得

  1:符合客戶要求的產(chǎn)品(質(zhì)粒+甘油菌 或者 病毒+polybrene);

  2:完整的電子版實(shí)驗(yàn)報(bào)告(包括實(shí)驗(yàn)材料,步驟,載體圖譜等);

  3:完整的測(cè)序報(bào)告;

 

  5.載體信息

 

載體編號(hào)

攜帶標(biāo)記

載體骨架主要元件

熒光

真核抗性

MicroRNA過(guò)表達(dá)慢病毒載體

pHY-LV-miR1.1

無(wú)

無(wú)

CMV-GFP-MCS

pHY-LV-miR1.2

GFP

無(wú)

CMV-GFP-MCS-PGK- Puromycin

MicroRNA抑制慢病毒載體

pHY-LV-KD1.1

GFP

無(wú)

U6-TuD RNA-CMV-GFP

pHY-LV-KD1.2

RFP

無(wú)

U6- TuD RNA -CMV-RFP

pHY-LV-KD1.4

無(wú)

puromycin

U6- TuD RNA -CMV-Puromycin

pHY-LV-KD2.1

GFP

無(wú)

U6- TuD RNA -EF1α-GFP

pHY-LV-KD3.1

GFP

無(wú)

U6- TuD RNA -UBC-GFP

pHY-LV-KD5.1

GFP

puromycin

U6- TuD RNA -CMV-GFP-PGK- Puromycin

pHY-LV-KD5.2

RFP

puromycin

U6- TuD RNA -CMV-RFP-PGK- Puromycin

pHY-LV-KD5.4

GFP

puromycin

U6- TuD RNA -UBC-GFP-PGK- Puromycin

3UTR報(bào)告基因慢病毒載體

pHY-LV-Report3.1

luciferase

無(wú)

CMV-luciferase-MCS