基于基因編輯質(zhì)粒的相關(guān)問(wèn)題討論

1、

Q:利用crsipr敲除，可以用瞬轉(zhuǎn)質(zhì)粒嘛？

A:可以！這樣做得到的細(xì)胞是mosaic，即有的細(xì)胞是基因組編輯了，有的則沒(méi)有；有的細(xì)胞基因敲除了，有點(diǎn)則沒(méi)有。如果只要改變部分細(xì)胞基因即可的話，則可以通過(guò)瞬轉(zhuǎn)，如以原代細(xì)胞為研究對(duì)象。

 

2、

Q:保存領(lǐng)到的質(zhì)粒和菌液，說(shuō)明書上說(shuō)質(zhì)粒保存溫度-20℃/-80℃，怎么決定？我把領(lǐng)到的裝質(zhì)粒和菌液的離心管插到一個(gè)管插上直接放進(jìn)-80℃冰箱可以嗎？

A:在兩個(gè)溫度下都可以保存，但請(qǐng)注意，質(zhì)?？杀４娴臅r(shí)間較短（1～2年）。建議將相應(yīng)的細(xì)菌加甘油，可在-80℃下長(zhǎng)久保存。細(xì)菌需要加冷凍保護(hù)劑甘油才能凍存到-80℃冰箱中，質(zhì)粒直接放入。

 

3、

Q:我想把CRISPR-Cas9質(zhì)粒的flag標(biāo)簽直接替換成GFP標(biāo)簽，是不是可以直接對(duì)FLAG標(biāo)簽附近的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切就可以了？謝謝！

A:FLAG附近沒(méi)有可以直接用于酶切的酶切位點(diǎn)。

 

4、

Q:請(qǐng)問(wèn)可以用cas9技術(shù)對(duì)腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行編輯嗎？

A:可以。

Q:在真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞里好改造？

A:多大的質(zhì)粒？一般改造質(zhì)粒在體外用常規(guī)的分子操作即可。

Q:轉(zhuǎn)過(guò)質(zhì)粒后用puro篩選細(xì)胞，細(xì)胞傳了幾代不怎么死了，請(qǐng)問(wèn)是剩下的這些細(xì)胞都是轉(zhuǎn)進(jìn)了質(zhì)粒呢還是傳代對(duì)細(xì)胞有影響，還是相當(dāng)于只用藥篩了一個(gè)生長(zhǎng)周期？

A:有可能是抗生素濃度過(guò)大造成的，如果質(zhì)粒表達(dá)熒光蛋白可以鏡檢一下，不過(guò)傳代次數(shù)多了熒光也會(huì)減弱。

 

5、

Q:我這邊用咱們的質(zhì)粒做了個(gè)敲除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果很不錯(cuò)，現(xiàn)在我對(duì)敲入很感興趣，想問(wèn)一下定點(diǎn)敲入的話，供體質(zhì)粒怎么選擇？

A:供體的設(shè)計(jì)取決于期望敲入DNA片段的情況。

 

6、

Q:cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后需要做CruiserTM酶篩選陽(yáng)性克隆嗎？是不是也需要確定一下基因敲除的效率約為多少呢？

A:我們建議的策略是直接測(cè)序，不建議酶切，因?yàn)橹苯訙y(cè)序結(jié)果更明確，性價(jià)比更高（可避免假陽(yáng)性結(jié)果），對(duì)于酶切，我們沒(méi)有成功經(jīng)驗(yàn)。

 

7、

Q:我想驗(yàn)證質(zhì)粒是否已整合到基因組上，想設(shè)計(jì)一對(duì)puro的引物，然后去基因組上擴(kuò)增，首先想拿質(zhì)粒上的這段puro基因去NCBI中先比對(duì)一下，我是應(yīng)該和pac基因的序列比對(duì)嗎？

A:你所說(shuō)的pac基因是什么意思？GenBank上應(yīng)該可以找到puro的編碼序列。上ncbi網(wǎng)頁(yè)，將pcr產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果直接比對(duì)（BLAST）就可以。

Q:我拿質(zhì)粒上的puro序列和puro的全序列進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在1650bp處的堿基發(fā)生了替換，這對(duì)puro的抗性會(huì)有影響嗎

A:看看是否為同義突變？一般不會(huì)有問(wèn)題。

 

8、

Q:我想用Crispr構(gòu)建一個(gè)基因敲除的慢病毒載體，在細(xì)胞里做loss of function，公司說(shuō)評(píng)估了一下我們的基因，回復(fù)sgRNA評(píng)分很低，沒(méi)辦法三保一，我想問(wèn)一下，在sgRNA評(píng)分低的情況下，這個(gè)基因還能不能做？

A:已有的軟件給出的sgRNA活性評(píng)價(jià)都是基于有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)未知的sgRNA活性推測(cè)只能具有參考意義。鑒于慢病毒包裝比較貴，而制備All-in-One的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒要便宜很多，因此建議首先在細(xì)胞系上（同物種，轉(zhuǎn)染效率高）先進(jìn)行sgRNA活性檢測(cè)，以篩選到有活性的sgRNA。一旦篩選到有活性的sgRNA，未來(lái)只要包裝一個(gè)有活性的sgRNA表達(dá)載體/Cas9表達(dá)載體的慢病毒即可。

 

9、

Q:我想請(qǐng)教一個(gè)問(wèn)題，我們用cas9工具慢病毒敲除一個(gè)A基因后，想再把帶有一個(gè)突變位點(diǎn)的A基因（帶有突變A基因的載體是質(zhì)粒）插入基因組內(nèi)，可以請(qǐng)教一下轉(zhuǎn)染了慢病毒之后多久之后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，這個(gè)突變基因插入基因組內(nèi)的成功率會(huì)比較高呢？

A:工作對(duì)象是原代細(xì)胞還是細(xì)胞系？

Q:細(xì)胞系。

A:那么質(zhì)粒轉(zhuǎn)染沒(méi)有問(wèn)題了。不過(guò)，有一個(gè)問(wèn)題，含突變位點(diǎn)的A基因是否會(huì)被病毒攜帶的基因組編輯工具所識(shí)別，如果是，成功重組的表達(dá)質(zhì)粒中的A基因會(huì)被基因組編輯工具所編輯，就有可能實(shí)現(xiàn)不了你的目標(biāo)。敲除可以考慮直接用質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)，敲入使用慢病毒，這樣更合理。

 

10、

Q:是否能將sgRNA單鏈序列（20+60）和Cas9蛋白共同注射到靶細(xì)胞，然后檢測(cè)編輯效果？

A:細(xì)胞系一般用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式遞送DNA形式基因組編輯工具、原代細(xì)胞用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)遞送DNA形式基因組編輯工具、受精卵用顯微注射方式遞送RNP形式基因組編輯工具。

 

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